熒光原位雜交儀有哪些操作注意事項(xiàng)？

熒光原位雜交（Fluorescence In Situ Hybridization, FISH）技術(shù)問世于20世紀(jì)70年代后期，其基本原理是利用標(biāo)記了熒光素的核酸作為探針，按照堿基互補(bǔ)原則，與待檢樣本中與之互補(bǔ)的核酸經(jīng)過變性-退火而形成雜交雙鏈核酸，通過熒光顯微鏡進(jìn)行檢測和分析。是一種在細(xì)胞遺傳學(xué)水平上檢測染色體及基因數(shù)目以及結(jié)構(gòu)異常的一種分子生物學(xué)技術(shù)。該技術(shù)具有快速、安全、靈敏度高、探針可長期保存的特點(diǎn)，已廣泛地應(yīng)用于細(xì)胞遺傳學(xué)、腫瘤學(xué)生物學(xué)、基因定位、基因作圖、基因擴(kuò)增、產(chǎn)前診斷等不同領(lǐng)域。

1 、開展FISH所需要的實(shí)驗(yàn)條件和人員培訓(xùn)

建立FISH技術(shù)平臺，除需要一間可以進(jìn)行熒光實(shí)驗(yàn)操作和顯微觀察暗室外，還需要原位雜交儀、熒光顯微鏡、顯微鏡濾光 片 、水浴箱 、漩渦混合器 、普通離心機(jī) 、移液器 、FISH探針試劑盒、無水乙醇、二甲苯、去離子水、橡膠水泥、透明指 甲油等設(shè)備和試劑。

由于FISH檢測具有敏感性和客觀性，任何一個(gè)步驟的微小失誤均有可能對結(jié)果的判讀產(chǎn)生偏差，進(jìn)而對臨床的合理用藥產(chǎn)生影響，因此就對操作的技術(shù)人員在熟練和規(guī)范程度做出更高的要求。作者建議每一個(gè)開展分子病理檢測的 病理科設(shè)置專門的分子病理室并由專人操作，并且要求專門的技術(shù)人員有相關(guān)的分子生物學(xué)理論知識，并經(jīng)過專門培訓(xùn)，有一定的實(shí)驗(yàn)室工作經(jīng)驗(yàn)。

2 、固定液的選擇及固定時(shí)間

石蠟組織建議用 10%中性緩沖福爾馬林固定 6~48h， 其它固定液對實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能產(chǎn)生一定的影響。組織離體后 應(yīng)盡快固定，建議在標(biāo)本離體后 30min內(nèi)固定。如樣本固定不及時(shí)，熒光信號會(huì)減弱。固定液的體積是組織體積的 4~20倍，否則固定不充分，容易出現(xiàn)無信號或者信號很弱的現(xiàn)象。而且，為了確保信號的準(zhǔn)確性，蠟塊盡量在2年內(nèi)進(jìn)行檢測，已經(jīng)切好的切片在 6周內(nèi)檢測為佳。

3 、組織切片和載玻片的選擇

組織切片 4~5μm厚，過厚或過薄的切片均會(huì)對信號的強(qiáng)弱產(chǎn)生影響，而且切片應(yīng)完整，質(zhì)量良好，否則會(huì)在預(yù)處理 時(shí)掉片。載玻片的選擇建議使用防脫載玻片，有條件的實(shí)驗(yàn) 室可使用更好的陽離子或者陰離子專用載玻片，可有效防止脫片現(xiàn)象的發(fā)生。

4 、實(shí)驗(yàn)過程中切片的預(yù)處理

切片預(yù)處理過程包括煮沸處理和蛋白酶消化。當(dāng)組織 處理不規(guī)范、切片過厚或烤片不足時(shí)，在煮沸過程中容易掉 片，建議烤片溫度在 56°C過夜。煮沸過程中要嚴(yán)格控制實(shí) 驗(yàn)溫度和時(shí)間。酶消化是 FISH實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟之一，如果 對組織不熟悉，可以先消化推薦的反應(yīng)時(shí)間，然后復(fù)染DAPI在熒光顯微鏡下觀察，在 DAPI通道下，以細(xì)胞既無空洞(消化過度)，亦 無明顯 的云霧狀 (消化不足 )為佳 ，同時(shí)可切換觀察紅綠通道，以紅綠通道無明顯的背景為佳，如果背景較高，可適當(dāng)延長消化時(shí)間。另外，對于陳舊的石蠟組織切片，要適當(dāng)延長消化時(shí)間，否則會(huì)出現(xiàn)大量的自發(fā)熒光。若 消化不足所致 FISH信號減弱或丟失，消化良好時(shí)FISH信號較好。

5、 變性和雜交

變性和雜交是本實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵的步驟，變性的時(shí)間和溫度是雜交成功是否的關(guān)鍵，為確保變性期間溫度的穩(wěn)定，建議采用專業(yè)的原位雜交儀進(jìn)行變性和雜交步驟，不僅能夠減少實(shí)驗(yàn)的繁瑣性，而且更有利于實(shí)驗(yàn)條件的控制，比如時(shí)間、溫度和避光條件等。為避免雜交液在變性和雜交過程 中的損失和防止干片，一定要在蓋玻片的四周用橡膠水泥進(jìn)行密封。

6、 雜交后洗滌溫度、時(shí)間和封片保存

雜交后的洗滌對于整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響非常重要，首先應(yīng)確保正確配置雜交洗滌液 ，洗滌液溫度偏高或時(shí)間過長 ，可導(dǎo)致信號減弱，洗滌液溫度偏低或者時(shí)間過短，會(huì)產(chǎn)生雜信號過多、紅綠信號對比性差或者特異性低等情況。

在復(fù)染完 DAPI以后，加蓋蓋玻片，用指甲油固定住蓋玻片四角，這樣可以防止在油鏡下觀察時(shí)蓋玻片脫落。由于 熒光信號容易淬滅，所以在染色后應(yīng)立即觀察，如果當(dāng)時(shí)不 能觀察，可將切片放入切片盒中，保存于 -20°C冰箱里2周以內(nèi)。

7、 設(shè)置對照

每次實(shí)驗(yàn)需設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)對照:實(shí)驗(yàn)室在每一輪檢測中均應(yīng)使用標(biāo)準(zhǔn)化對照材料(陽性、陰性和可疑)。如果對照材料 沒有顯示預(yù)期的結(jié)果，則不能對結(jié)果做出判定。

8、 結(jié)果判讀

應(yīng)選擇細(xì)胞核大小一致、核邊界完整、DAPI染色均一 、 細(xì)胞核無重疊、信號清晰的細(xì)胞。隨機(jī)計(jì)數(shù)至少20個(gè)浸潤性癌細(xì)胞核中的雙色信號。判讀標(biāo)準(zhǔn)參考專業(yè)書籍，對于FISH結(jié)果不確定的病例，需要再計(jì)算 20個(gè)細(xì)胞核中的信號或由另外一位病理診斷醫(yī)師重 新計(jì)數(shù)。如仍為臨界值，則應(yīng)行免疫組化檢測(若FISH檢測前未行)，也可以選取不同的組織塊重新檢測。