通過原位雜交儀操縱編輯結(jié)果的細(xì)胞決定因素來(lái)增強(qiáng)主要編輯系統(tǒng)

雖然引物編輯能夠在 DNA 中實(shí)現(xiàn)序列變化，但引物編輯的細(xì)胞決定因素仍然知之甚少。使用匯集的 CRISPRi 篩選，我們發(fā)現(xiàn) DNA 錯(cuò)配修復(fù) (MMR) 阻礙了主要編輯并促進(jìn)了不需要的 indel 副產(chǎn)物。我們開發(fā)了 PE4 和 PE5 引物編輯系統(tǒng)，其中與 PE2 和 PE3 系統(tǒng)相比，工程化 MMR 抑制蛋白的瞬時(shí)表達(dá)將替換、小插入和小缺失引物編輯的效率提高了平均 7.7 倍和 2.0 倍，分別，同時(shí)在 MMR 熟練的細(xì)胞類型中將編輯/插入刪除比率提高了 3.4 倍。在預(yù)期編輯附近戰(zhàn)略性地安裝沉默突變可以通過規(guī)避 MMR 來(lái)增強(qiáng)主要編輯結(jié)果。Prime 編輯器蛋白質(zhì)優(yōu)化產(chǎn)生了 PEmax 架構(gòu)，將編輯效率提高了 2。在 HeLa 細(xì)胞中平均為 8 倍。這些發(fā)現(xiàn)豐富了我們對(duì)主要編輯的理解，并建立了主要編輯系統(tǒng)，該系統(tǒng)在 7 種哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型的 191 次編輯中顯示出實(shí)質(zhì)性改進(jìn)。

使用匯集的 CRISPRi 篩選，我們發(fā)現(xiàn) MMR 活動(dòng)強(qiáng)烈抑制了替代主要編輯的效率和結(jié)果純度。這些見解為共表達(dá) MLH1dn 的 PE4 和 PE5 系統(tǒng)的開發(fā)提供了信息，以瞬時(shí)抑制 MMR，增強(qiáng)主要編輯效率，并減少插入缺失而不引起大量脫靶基因組變化。對(duì)主要編輯器蛋白的優(yōu)化產(chǎn)生了一種 PEmax 架構(gòu)，可以與 PE4 和 PE5 系統(tǒng)以及 epegRNA 協(xié)同工作。以進(jìn)一步提高主要編輯性能?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)支持的引物編輯 DNA 修復(fù)模型、為規(guī)避引物編輯瓶頸而開發(fā)的 PE4 和 PE5 策略以及此處描述的改進(jìn)的 PEmax 引物編輯器架構(gòu)大大推進(jìn)了引物編輯在基因組操作中的效用。

PE4 和 PE5 在 191 種不同的主要編輯中的廣泛表征表明，由于相應(yīng)的主要編輯中間體能夠規(guī)避 MMR，主要編輯可以更高效地安裝某些類型的編輯。除了編輯類型之外，其他屬性也可能影響主要編輯對(duì) MMR 的敏感性，例如目標(biāo)站點(diǎn)的序列上下文。此外，MMR 更有效地修復(fù)早期復(fù)制的常染色質(zhì)和復(fù)制過程中的滯后鏈 DNA 。需要對(duì)更大的編輯集進(jìn)行系統(tǒng)研究，以全面闡明這些編輯類型、序列上下文和位點(diǎn)狀態(tài)對(duì) MMR 和主要編輯的依賴性。Repair-seq 將來(lái)也可能用于闡明其他類型的主要編輯，例如長(zhǎng)插入或刪除，并建議其他改進(jìn)的主要編輯系統(tǒng)。

我們原位雜交儀對(duì) MMR 修復(fù)的主要編輯中間體類型的研究使研究人員能夠設(shè)計(jì)主要編輯實(shí)驗(yàn)來(lái)逃避 MMR，即使沒有 MLH1dn 的表達(dá)。我們表明，戰(zhàn)略性地安裝額外的附近沉默突變可以通過避免主要編輯中間體的 MMR 逆轉(zhuǎn)來(lái)增強(qiáng)主要編輯結(jié)果。MMR 抑制的其他方式也可能證明有利于主要編輯。雖然沒有報(bào)道選擇性靶向 MMR 的小分子，但化學(xué)抑制劑在受 MLH1dn 傳遞限制的應(yīng)用中很有用。對(duì)于維持長(zhǎng)期主要編輯器表達(dá)的病毒遞送等用途，RNA 干擾可能提供一種替代方法來(lái)瞬時(shí)抑制 MMR 活性。

PE4 和 PE5 系統(tǒng)通過 PEmax 和 epegRNA 的改進(jìn)，在經(jīng)過測(cè)試的七種哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型中強(qiáng)大地增強(qiáng)了主要編輯性能。帶有 epegRNA 的 PE4max 以獨(dú)特的方式實(shí)現(xiàn)高效的引物編輯，插入/缺失副產(chǎn)物少，特別是在具有活性 MMR 的細(xì)胞中，使其至適合需要高結(jié)果純度或不能使用切口 sgRNA 的基因編輯應(yīng)用。相比之下，與 PE3 系統(tǒng)相比，帶有 epegRNA 的 PE5max 實(shí)現(xiàn)了至高水平的引物編輯，同時(shí)減少了插入缺失結(jié)果。因此，我們建議在大多數(shù)主要編輯應(yīng)用程序中使用 PE5max 和 epegRNA。